中國藥科大學(xué)姜虎林教授團(tuán)隊(duì)采用Umibio外泌體專用裂解液

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)和腫瘤源性外泌體(TDEs)在轉(zhuǎn)移級聯(lián)中發(fā)揮著不可替代的作用，阻止它們通過血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處器官有助于降低癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性。然而，能夠同時(shí)阻止ctc和tde到達(dá)遠(yuǎn)端器官的技術(shù)到目前為止還沒有得到徹底的發(fā)展。在這里，受血液灌流的啟發(fā)，開發(fā)了一種促轉(zhuǎn)移衍生物消除劑(PMDE)，用于從外周血中去除ctc和tde，同時(shí)抑制它們在遠(yuǎn)處器官的生物分布。該裝置設(shè)計(jì)了一種雙抗體修飾的免疫吸附劑，填充在捕獲柱中，將外周血從體內(nèi)抽出，流經(jīng)該柱特異性地捕獲ctc和tde，然后將純化后的血液重新輸入體內(nèi)。PMDE能有效去除外周血中的ctc和tde，具有良好的生物相容性。有趣的是，PMDE裝置可以通過清除ctc和tde來抑制他們在肺和肝臟中的生物分布。這項(xiàng)工作為抗轉(zhuǎn)移治療提供了新的視角，在預(yù)防轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

圖1 A) tde、ctc和轉(zhuǎn)移之間的三角關(guān)系示意圖。B)說明促轉(zhuǎn)移衍生物清除器機(jī)制。

首先作者使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗體進(jìn)行偶聯(lián)，通過倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像表征，發(fā)現(xiàn)抗體可以成功偶聯(lián)至微球表面；使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗體，建立了抗體濃度和熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察 anti-EpCAM、anti-EGFR 抗體的偶聯(lián)密度和偶聯(lián)效率，得到較高的抗體偶聯(lián)密度，每毫克抗體功能化的微球，具有 1011 個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)；通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)，考察了抗體在堿性條件下的抗原識別活性，發(fā)現(xiàn)抗體經(jīng)碳酸鹽偶聯(lián)液處理后依然保持原有的抗原識別活性；考察抗體功能化 SM 在 4 °C，避光條件下可儲存 60 天以上，具備良好的儲存穩(wěn)定性；

圖2 腫瘤特異性抗體功能化的瓊脂糖微球的表征與驗(yàn)證

緊接著，作者在靜態(tài)條件下驗(yàn)證了SM-EE 對 CTCs 和 TDEs 的捕獲能力；確證了模型 CTCs 和 TDEs 的標(biāo)志物 EpCAM、EGFR 的表達(dá)，

MDA-MB-468 作為模型 CTCs，它的外泌體作為模型 TDEs；

HeLa 及其外泌體作為陰性對照；使用激光共聚焦成像對抗體功能化的 SM 捕獲 CTCs 和 TDEs 進(jìn)行可視化表征，發(fā)現(xiàn)CTCs 和 TDEs 可以被成功捕獲；DAPI 染色的細(xì)胞或者 DiR 染色的外泌體在濃度-熒光強(qiáng)度方面呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以此建立了捕獲效率的計(jì)算方法； 考察了四種不同 SM 的捕獲效率，發(fā)現(xiàn) SM-EE 的捕獲效率最高，證明多價(jià)抗體使用的必要性，SM-EE 被選擇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；考察 SM-EE 投入的量、捕獲時(shí)間、SM-EE 儲存時(shí)間對捕獲效率的影響。發(fā)現(xiàn)微球投入越多，捕獲效率越高；捕獲時(shí)間在 60 min 基本達(dá)峰值；微球儲存 60 天依然保持原有的捕獲效率，證明微球具有良好的儲存穩(wěn)定性。

圖3 在靜態(tài)條件下捕獲癌細(xì)胞和tde

然后，作者闡述了在閉環(huán)循環(huán)系統(tǒng)模擬實(shí)驗(yàn)中，影響捕獲效率的因素。在閉環(huán)循環(huán)系統(tǒng)模擬實(shí)驗(yàn)中，考察了捕獲柱填料量、循環(huán)時(shí)間、循環(huán)流速、循環(huán)介質(zhì)、CTCs 與 TDEs 相互作用對捕獲效率的影響，同時(shí)也考察了PMDE 的捕獲專一性，為后續(xù)動物在體循環(huán)實(shí)驗(yàn)提供了參數(shù)設(shè)置的參考。結(jié)果表明，以 SM-EE 為免疫吸附劑的 PMDE，對 CTCs 和 TDEs 有較好的捕獲效率，CTCs 和 TDEs 的捕獲效率分別可達(dá) 53.5 ± 5.9 %和42.0 ± 3.0 %。

圖4 閉環(huán)循環(huán)系統(tǒng)中使用PMDE去除ctc和tde

在隨后的研究中，作者考察了從 PMDE 中釋放 CTCs 和 TDEs 作為腫瘤樣本的可行性。首先，考察了CTCs 和 TDEs 從 SM-EE 中的釋放效率，發(fā)現(xiàn)釋放效率分別可達(dá)92.7 ± 1.2 % 和 85.6 ± 1.3 %；其次，考察了經(jīng) SM-EE 釋放的外泌體相比于超速離心法獲得的外泌體的純度，其相對純度為 85.9 ± 3.2 %；并考察了釋放后外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小，發(fā)現(xiàn)釋放的外泌體依然保持完整的囊泡的結(jié)構(gòu)，不受捕獲和釋放過程的影響；最后，考察了 CTCs 經(jīng) SM-EE 釋放后的活性以及增殖能力，發(fā)現(xiàn) CTCs 被釋放后，保持良好的細(xì)胞活性和較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力，幾乎不受捕獲和釋放過程的影響。

圖5 釋放捕獲的CTCs和tde

接下來，作者考察了PMDE 血液相容性和生物相容性。以已上市的血液灌流材料 Biosky 吸附劑為對照，從紅細(xì)胞相容性、血漿蛋白吸附、血小板激活、凝血性質(zhì)、血常規(guī)、細(xì)胞相容性等方面考察SM-EE 的生物安全性，證明了 SM-EE 具有良好的血液相容性和生物相容性。

圖5 釋放捕獲的CTCs和tde

接下來，作者考察了PMDE 血液相容性和生物相容性。以已上市的血液灌流材料 Biosky 吸附劑為對照，從紅細(xì)胞相容性、血漿蛋白吸附、血小板激活、凝血性質(zhì)、血常規(guī)、細(xì)胞相容性等方面考察SM-EE 的生物安全性，證明了 SM-EE 具有良好的血液相容性和生物相容性。

圖7 在大鼠模型中的雙重清除CTCs和TDEs及PMDE的體內(nèi)生物安全性評價(jià)

為了進(jìn)一步研究 PMDE 抗轉(zhuǎn)移治療的潛力，作者進(jìn)行了概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為減少實(shí)驗(yàn)偏差，以 SM-BSA 為陰性對照，以未處理組為空白對照。如圖 7 描述了尾靜脈注射后 3 h 獲得的小鼠體內(nèi)熒光圖像。無論實(shí)驗(yàn)對象是 CTCs、TDEs 還是兩者，SM-EE 組的熒光信號均顯著最低，表明 CTCs 和 TDEs 向各臟器分布最少。

圖8 PMDE抑制ctc和tde向遠(yuǎn)處器官的生物分布

綜上所述，本研究提供了一種很有前景的方法，可以同時(shí)減少CTCs和TDEs通過血流分布到遠(yuǎn)處器官，在預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。該研究以“A Pro-Metastatic Derivatives Eliminator for In VivoDual-Removal of Circulating Tumor Cells and Tumor-Derived Exosomes Impedes their Biodistribution into Distant Organs”為題發(fā)表在國際高水平學(xué)術(shù)期刊Advanced Science雜志上，中國藥科大學(xué)為第一作者及第一通訊作者單位，第一作者為中國藥科大學(xué)研究生孫應(yīng)，通訊作者為中國藥科大學(xué)藥學(xué)院姜虎林教授。該研究裂解外泌體所用的外泌體專用裂解液由上海宇玫博生物科技有限公司（Shanghai Umibio Co., Ltd.）提供。